4D 프린팅으로 근육재생 및 척추유합 세포담체 개발-근세포가 길이방향으로 배열해 자랄 수 있도록 유도

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2021. 5. 29.

4D 프린팅으로 근육재생 및 척추유합 세포담체 개발-근세포가 길이방향으로 배열해 자랄 수 있도록 유도

 

등록일2021.05.24.

 

 

 

4D 프린팅으로 근육재생 및 척추유합 세포담체 개발

근세포가 길이방향으로 배열해 자랄 수 있도록 유도

골세포 주변의 혈관생성 유도해 골재생 촉진 

 

 

□ 4D 프린팅으로 근육전구세포가 포함된 바이오잉크의 자가배열을 유도, 가지런한 근섬유 다발이 만들어져 주목받고 있다. 

 ○ 기존 3D 프린팅으로는 세포가 한 방향으로 배열된 근섬유 다발인, 근육의 방향성을 구현해 내기에 한계가 있었다. 

   ※ 4D 프린팅 : 3D 프린팅된 구조물에 물질의 다양한 물리-화학적 특성을 이용하여 자가변형 기능을 가능하게 하는 기술

 

□ 한국연구재단(이사장 노정혜)은 김근형 교수(성균관대학교), 이상진 교수(Wake Forest Institute for Regenerative Medicine) 연구팀이 4D 프린팅 기술로 세포배열을 조절할 수 있는 바이오잉크 기반 세포담체※ 를 개발하고, 근육 손실 동물모델에서의 효과를 확인했다고 밝혔다.

   ※ 세포담체(scaffold) : 세포가 원하는 조직으로 증식, 분화될 수 있도록 미세공간을 제공하고 외부 균의 침입을 억제하는 세포의 집과 같은 지지체

 

□ 살아있는 세포가 포함된 바이오잉크로 저마다의 해부학적 특징과 생리학적 기능을 가진 조직으로 구현하는 바이오프린팅 연구가 활발한 가운데 연구팀은 4D 프린팅 기술로 바이오잉크에 포함된 인간 근육 전구세포가 자라나는 방향을 제어하는 데 성공했다.  

□ 나아가 손가락 크기(길이 15mm, 너비 7mm 깊이 3mm)의 치명적 근육손실이 있는 쥐의 전경골근에 자가 배열기능을 갖는 세포구조체를 이식하고 8주 후 이식 부위가 실제 근육처럼 재생되는 것을 확인하였다. 

 

□ 핵심은 프린팅 조건을 최적화하여 바이오잉크에 포함된 합성고분자의 배열을 제어함으로써 근섬유 다발처럼 정렬된 근육 모사 구조체를 제작한 것이다. 

 ○ 근육세포에 최적의 지형적, 생물학적 환경을 제공하여, 근세포의 분화 및 재생 효과를 높였다는 설명이다. 또한 세포담체에 포함된 근육 전구세포의 세포생존율도 높은(90%) 것으로 나타났다. 

 

□ 연구팀은 근육조직 외에도 배열화된 다른 조직들 예를 들면 심근조직, 신경조직, 인대 등에도 응용할 수 있을 것으로 보고 있다. 

 

□ 한편 연구팀은 4D 프린팅 기술을 이용해 차의과대학 한인보 교수 연구팀과 함께 골조직 재생을 도울 세포담체를 개발, 척추유합 생쥐모델에 적용, 골조직 재생 효과를 확인하였다. 

 ○ 기존 골이식재가 혈관연결이 없는데 반해 미세채널 구조를 포함한 세포담체로 이식부위 주변 조직에서 혈관이 효율적으로 생성될 수 있도록 고안한 것이다. 

 

□ 과학기술정보통신부‧한국연구재단이 추진하는 중견연구지원사업 및 자연모사혁신기술개발사업의 지원으로 수행된 이번 연구는 응용 물리학 분야 국제학술지 어플라이드 피직스 리뷰(Applied Physics Reviews)에 5월 4일(뼈조직 재생) 및 5월 12일(근육 재생)에 게재(featured article)되었다.

 

주요내용 설명

 

 <작성 : 성균관대학교 김근형 교수>

 

논문명

Self-aligned myofibers in 3D bioprinted extracellular matrix -based construct accelerate skeletal muscle function restoration

저널명 

Applied Physics Reviews

키워드 

skeletal muscle (골격근), alignment (배열성), neuromuscular junction (신경근 접합부), functional restoration (기능의 회복), 3D bioprinting (3D 바이오프린팅), tissue engineering (조직재생 공학)

DOI

10.1063/5.0039639

저  자

김근형(성균관대학교, 교신저자), 이상진(Wake Forest Institute for Regenerative Medicine, 교신저자), 이형진(Wake Forest Institute for Regenerative Medicine, 제1저자), 김원진( 성균관대학교, 제1저자)

 

 

논문명

Bone tissue engineering via application of a collagen /hydroxyapatite 4D-printed biomimetic scaffold for spinal fusion

저널명 

Applied Physics Reviews

키워드 

4D printing (4D 프린팅), collagen/HA scaffold (콜라겐/수산화인회석 세포담체), microchanneled structure (미세체널화 구조), spinal fusion (척추유합), bone regeneration (뼈재생)

DOI

10.1063/5.0035601

저  자

김근형(성균관대학교, 교신저자), 한인보 (차의과대학교, 교신저자), 황보한준 학생(성균관대학교,제1저자), 이형진 박사(성균관대학교, 제1저자), 노은지 학생 (차의과대학교, 제1저자)

 

1. 연구의 필요성

○ 인체를 이루는 각 조직은 해부학적/생리학적으로 그 기능에 맞는 특성과 환경을 지니고 있다. 또한 조직을 이루는 각 세포들의 효과적인 대사작용(metabolism), 물질의 교환, 전기신호의 전달 등을 위해 혈관, 림프관, 신경다발 등을 포함하고 있다. 때문에 조직에 손상이 가해졌을 경우 조직의 특징과 기능 등을 지원해 주는 것이 보다 신속하고 성공적인 조직 재생을 위한 우수한 전략이 될 수 있다.

○ 근육은 한 방향으로 배열된 섬유다발로 이루어져 있으며, 전기적 신호전달에 의한 수축·이완을 통해 근육운동을 한다. 때문에 조직 재생공학에서는 이러한 근육의 해부학적/생리학적 구조의 모사를 통해 보다 효과적으로 근육 조직을 복구하려는 시도가 계속되어 왔다.

○ 특히 전기방사, 리소그래피, 마이크로-몰딩 등 일반적인 세포담체 제작 공정은 2D 구조체로 배열된 표면을 만든 후 근육세포를 도포하여 한 방향으로 배열된 형태의 조직으로 성장시키는 방법이 사용된다. 

○ 하지만 외상으로 부피가 큰 체적 근육 손실이 발생할 경우 이 방식은 근육 재생에 한계가 있어 세포가 포함된 바이오잉크를 이용하는 세포- 프린팅 공정을 통한  이식용 세포지지체의 제작이 불가피하다. 하지만 기존 바이오잉크를 이용한 세포-프린팅 공정은 마이크로/나노패턴 형성에 한계가 있어 한 방향으로 세포가 정렬된 구조를 제작하는데 어려움이 있다.

○ 따라서 근육조직 재생용 3D 세포지지체를 만들 때 정렬된 마이크로 /나노패턴을 제공할 수 있는 바이오잉크의 개발 및 새로운 세포-프린팅 공정 방법이 필요하다.

○ 한편 골조직 재생을 위한 세포담체 제작 기술에서는 인체 뼈의 구성 물질 중 가장 큰 부피를 차지하는 콜라겐과 HA를 활용한 제작이 일반적이었다. 하지만 이식 후 신생 혈관 유도에 큰 이점을 지니지 못하며, 이를 해결하기 위해 많은 연구자들은 다양한 전략들을 활용해 왔다. 

○ 특히 3D 프린팅 공정을 통해 제작된 세포담체는 수백 마이크로 단위의 비교적 큰 공극들로 이루어진 다공성 구조체로 제작되기 때문에 체내에 이식하였을 때 미세한 혈관형성에 어려움이 있는 실정이다. 이러한 이유로 인해 뼈 조직재생공학에서는 신생혈관을 효과적으로 유도 시킬 수 있는 구조적/물질적 특성이 부여된 세포담체를 제작하기 위한 신개념의 공정 기술이 요구된다.

 

2. 연구내용 

 

○ 연구팀은 부피가 큰 근육 손실 부위의 재생을 위해 광경화 (photo-crosslinkable)가 가능한 탈세포화 기반 바이오잉크를 합성 고분자인 Poly(vinyl alcohol)(PVA)를 첨가하여 사용해 이식용 3D 인공근육을 제작하고자 했다. 

○ 연구팀은 세포 배열을 유도하기 위해 프린팅 노즐 내의 바이오잉크 흐름에 의한 전단 응력(shear stress)을 활용하였다. 이 때, 바이오잉크의 체적유량과 프린팅 속도 등의 조절을 통해 바이오잉크의 내부의 섬유화된 PVA 분자를 프린팅 방향으로 성공적으로 정렬시킬 수 있었다. 이후 정립된 조건에서 침출 방법을 통해 PVA를 제거함으로써 구조체 내부의 세포들을 한 방향으로 배열하는 것이 가능했다. 이를 통해 제작된 구조체에 포함된 인간근육전구세포는 90%가 넘는 높은 초기 세포생존율을 보였다. 

○ 제작된 3D 인공근육은 기존의 구조체(배열되지 않은 구조)와 세포 성장 및 성숙을 비교하였다. 배양 7일차 이후부터 배열이 유도된 구조체는 비교군에 비해 1.7배 이상 배열된 세포골격을 보였으며 마이오신 중쇄 (MHC) 염색했을 때 배양 21일차에 1.8배 이상의 높은 분화도를 확인할 수 있었다.

○ 또한 제작된 인공근육을 쥐(rat)의 전경골근(tibialis anterior (TA) muscle) 체적손상모델에 이식하였을 때 8주 후 이식 한 부위의 조직이 실제 근육과 같이 완벽히 재생되었다. 특히 4D 프린팅된 근육 구조체에 포함된 인간 근육 전구세포는 기존의 근육 구조체 보다 근섬유가 빠르게 형성되어 재생 및 기능 복구에 도움을 주는 것을 확인하였다. 

 

○ 또한 연구팀은 4D 프린팅 기술 및 뼈 조직을 구성하는 생체 물질을 이용하여 신생혈관 유도 및 뼈 조직을 효과적으로 재생할 수 있는 세포담체 제작 기술 방법을 고안하였다. 두 가지 유변학적 특성이 다른 합성고분자 혼합물을 이용하여 마이크로 크기의 노즐에서 혼합물이 프린터에서 압출될 때 노즐 내부에 가해지는 전단응력에 의한 레일리 불안정성(Rayleigh disturbance)현상을 이용하여 미세 섬유다발로 구성된 복합체를 제작하였다. 

○ 제작된 구조체의 섬유다발에 콜라겐을 코팅시킨 후 섬유다발을 제거하여 마이크로 미세채널이 포함된 콜라겐 구조물을 제작하였고, 제작된 콜라겐 세포담체를 생광물화(biomineralization) 과정을 통해 미세채널이 포함된 콜라겐/HA 세포담체를 제작하였다.

○ 일련의 공정과정을 거쳐 제작된 미세채널이 포함된 콜라겐/HA 세포 담체에 사람 지방유래 줄기세포(hASC, human adipose-derived stem cell)를 배양하였을 때 기존의 제작 방식을 활용해 제작한 미세채널이 없는 세포담체에 비해 약 1.2배의 세포 성장율을 보였으며, 특히 미세채널 내부에까지 세포가 부착 및 유입되어 성장하는 것을 확인할 수 있었다. 또한 21일의 배양 기간을 통해 기존 구조체에 비해 약 1.4배 이상의 높은 골분화 관련 유전자(osteopontin, osteocalcin 등) 발현을 확인할 수 있었다.

○ 또한 미세채널이 포함된 콜라겐/HA 구조체와 기존 제작방식을 통해 제작한 미세채널이 없는 세포담체를 쥐의 척추 유합모델에 이식하여 6주 뒤에 이식제의 척추유합과 골재생을 확인하였다. 미세채널이 포함된 콜라겐/HA 세포담체가 기존의 구조체에 비해 약 2.3배 이상의 유합율을 보여주었으며, 2.5배 이상의 신생 골 조직 및 혈관 형성을 확인할 수 있었다. 이를 통해 콜라겐/HA 구조체에 포함된 미세채널이 세포의 활성과 이식 환경에서 주변 골 조직, 혈관의 유도를 촉진시켜 골 재생에 있어서 효과적으로 작용하는 것을 확인하였다.

 

3. 연구성과/기대효과

○ 본 연구에서는 기존의 근육 및 뼈 조직 재생을 위한 세포담체가 지닌 단점들을 극복할 수 있도록 4D-프린팅 공정 및 조직을 구성하는 주요 생체물질들을 이용하여 해부학적 특징 및 생리학적 기능을 모사한 세포담체를 제작하였다. 

○ 제작된 인공 근육 세포담체는 세포가 일정한 방향으로 성장을 유도 하며, 이를 바탕으로 일렬로 배열돼 융합하여 성숙되는 것을 확인 하였다. 또한 뼈 조직 세포담체는 구조체 내의 미세채널(~30 ㎛)로 인해 신생 혈관 유도에 효과적이었다. 이러한 4D 프린팅을 통해 제작된 세포담체들은 동물 모델에 적용되었고, 기존 3D 프린팅으로 제작된 세포담체에 비해 월등히 향상된 근육 및 뼈 조직 재생을 확인 할 수 있었다.

○ 본 연구에서 제안된 4D-프린팅 공정 및 이를 이용하여 제작된 세포 담체는 향후, 근육 조직 및 뼈 조직 뿐 아니라 다양한 인체 조직들 예를 들어 신경조직, 심장근육, 및 인대 등에 효과적인 조직공학용 세포담체로 응용될 수 있을 것으로 기대된다.

 

그림 설명

 

 

 

 

(그림 1) 4D 프린팅으로 만든 근육 구조체의 손상근육 재생 유도 효과 

실제 쥐의 근육(왼쪽), 손상된 쥐의 근육(가운데) 및 쥐의 손상된 근육에 근육구조체를 이식한 후 근육이 재생된 사진(오른쪽)

4D 프린팅 공정을 통해 제작된 근육 조직체를 손상된 쥐의 근육 부위에 이식 8주 후 근섬유(빨간색 염색)가 잘 배열된 것과 세포핵(파란색)이 근섬유의 중앙에 위치 한 것 등을 통해 인간 근육전구세포로부터 근섬유 재생이 효과적으로 이뤄진 것을 형광현미경을 통해 확인할 수 있다. 

 

 

 

(그림 2) 미세채널 포함 콜라겐/HA 세포담체 모식도 및 주사전자현미경 사진

4D 프린팅으로 제작한 골 조직체의 표면, 단면(수직/수평) 및 미세채널 구조(위)와 골 재생 및 신생 혈관 유도 과정에 대한 모식도(아래). 

(위) 콜라겐/하이드록시아파타이트(HA)로 제작된 골 조직체. 표면과 단면 (수직/수평)을 주사전자현미경으로 살펴본 결과 단방향으로 배열된 패턴과 내부의 미세채널을 확인할 수 있다.

(아래) 4D 프린팅된 골 조직체에 모사된 미세체널을 통해 골 이식 부위에서 줄기세포의 유입이 이루어지고, 이와 동시에 신생혈관이 유도되면서 골 재생의 가속화가 이루어진다. 

 

연구 이야기

 

                                         <작성 : 성균관대학교 김근형 교수>

 

□ 연구를 시작한 계기나 배경은? 

 

고령화에 따라 근위축증, 근이영양증과 같은 근육 질병 및 척추협착증, 척추골절, 진행성 기형 같은 관절 및 뼈 질환 등이 현저하게 증가하면서 조직공학 세포담체를 이용해 이들 조직을 보완하려는 연구가 이어지고 있습니다. 

우리 연구팀도 조직공학적 지식을 바탕으로 효율적인 근육 및 뼈 재생을 유도하는 생체모방 세포담체를 개발하고 있습니다. 구체적으로 4D 프린팅의 단방향 형상 변형(one–way -shape-morphing) 메커니즘을 통해 미세 섬유다발과 같은 근육 모사구조체를 제작하고자 하였습니다. 또한 미세채널이 있는 콜라겐/ 하이드록시아파타이트 뼈 조직 재생용 세포담체 제작을 통해 각각의 조직 세포의 성장 및 분화를 돕고자 하였습니다.

 

 

□ 이번 성과, 무엇이 다른가? 

 

기존 보고된 3D 프린팅을 이용해 제작한 근육 및 뼈 조직 재생용 구조체는 실제 조직의 해부학적 구조 및 생리학적 기능을 모사하는 데 한계가 있었습니다. 기존 3D 프린팅 방법은 인체 조직의 구조적/물리적 모사는 가능하지만 미세한 해부학적 환경을 모사하기에는 어려움이 있습니다. 이에 본 연구팀은 단방향 형상 변형을 통한 인체의 구조적/해부학적 구조는 물론 미세 환경을 모사할 수 있는 4D 프린팅 기술 방식을 도입하고자 하였습니다. 

이를 통해 제작된 세포담체는 세포의 배열을 효율적으로 유도하거나, 세포담체 내부로 세포의 침투율을 획기적으로 향상시켜 근육 및 뼈 재생을 돕는데 도움이 될 것으로 기대하였습니다. 이렇게 각각의 뼈 및 근육 조직에 특화된 생체적합성 소재 및 4D 프린팅 공정을 통해 제작된 세포담체는 실제 동물모델을 이용한 연구에서 손상된 조직을 완벽하게 재생시킬 수 있었습니다.

 

 

□ 실용화된다면 어떻게 활용될 수 있나? 실용화를 위한 과제는?

 

개발한 근육 및 뼈 조직은 단순한 타박상에 의한 작은 범위의 손상 뿐 아니라 큰 외상에 의한 조직 손상 등에도 응용할 수 있을 것입니다. 실용화를 위해서는 다양한 세포를 세포담체에 접목시켜 그 효용성에 대한 연구 및 동물모델을 이용한 연구, 실제 사람에서의 임상연구 등이 추가적으로 필요 할 것입니다.