고삐 풀린 면역세포 제어 위한 펩타이드 제안-면역세포의 과도한 활성으로 인한 자가면역 제어 기대

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2021. 8. 1.

고삐 풀린 면역세포 제어 위한 펩타이드 제안-면역세포의 과도한 활성으로 인한 자가면역 제어 기대

 

등록일2021.07.30.

 

 

 

고삐 풀린 면역세포 제어 위한 펩타이드 제안 

면역세포의 과도한 활성으로 인한 자가면역 제어 기대 

다발성 경화증 동물모델에서 염증완화 효과 확인  

  

 

 

□ 자기 세포를 공격하는 면역세포의 과도한 활성을 줄여줄 작은 단백질 조각, 펩타이드가 소개되었다. 

○ 면역세포의 과도한 활성을 제어하는 조절 T 세포의 분화를 도와 지속적으로 자가면역질환 및 재발 억제에 유리한 전략이 될 수 있을지 기대를 모으고 있다. 

 

□ 한국연구재단(이사장 노정혜)은 최제민 교수(한양대학교 생명과학과) 연구팀이 다발성 경화증 같은 자가면역질환에서 둔화된 조절 T 세포의 분화를 촉진할 수 있는 펩타이드를 설계하고 동물모델을 통해 펩타이드의 분화촉진 효과를 확인했다고 밝혔다. 

 

□ 면역세포의 과도한 활성은 자기 세포를 공격하는 자가면역질환으로 이어질 수 있는데, 실제 이들 질환에서는 면역세포의 활성을 조절하는 조절 T 세포의 수와 기능이 저하되어 있다. 

○ 환자의 혈액세포에서 조절 T 세포를 분리하여 체외에서 증식후 다시 체내로 주입하는 치료법이 적용되고 있으나 체외에서 증식된 세포가 체내에서 기능하는데 한계가 있었다.  

○ 이에 체내에서 조절 T 세포의 분화를 도울 수 있는 방법에 대한 연구가 이뤄지고 있었다. 

 

□ 조절 T 세포에 많이 존재하는 CTLA-4 단백질은 면역 활성 조절에 필수적이라는 것이 잘 알려져 있으나 조절 T 세포의 분화를 유도하는 능력에 대해서는 알려진 바가 없었다. 

 

□ 연구팀은 CTLA-4의 신호전달도메인에 세포막을 잘 통과할 수 있는 펩타이드 조각을 연결한 펩타이드를 설계했다. 

○ 혈액 등을 통해 노출시 세포 및 조직 내로 효과적으로 들어갈 들어가 조절 T 세포의 분화를 도울 것으로 기대한 것이다. 

 

□ 실제 다발성경화증 환자 유래 세포 및 다발성 경화증 생쥐모델에 이 펩타이드를 투여하자 생체 내에서 조절 T 세포의 분화가 촉진, 수가 늘어나는 것을 확인했다. 

○ 특히 투여를 중단하더라도 약 100일까지 효과가 있었다는 설명이다. 

○ 하지만 조절 T 세포를 없애는 항체를 투여하자 펩타이드 투여에 따른 염증 완화 효과가 사라져, 펩타이드의 작용표적이 조절 T 세포임을 확인하였다. 

 

□ 다만 실제 응용을 위해서는 안전성과 안정성을 고려한 최적화된 펩타이드 서열 도출을 위한 추가 연구 및 실제 환자에서의 임상연구 등이 필요하다. 

○ 과학기술정보통신부와 한국연구재단이 추진하는 바이오의료기술개발사업, 중견연구자지원사업, 뇌과학원천기술개발사업의 지원으로 수행된 이 연구 성과는 2021년 7월 21일국제학술지 ‘어드밴스드 사이언스 (Advanced Science)’에 게재되었으며, 저널의 표지로 선정되었다.  

 

주요내용 설명

 

 <작성 : 한양대학교 최제민 교수>

 

논문명

In Vivo Induction of Regulatory T Cells Via CTLA‐4 Signaling Peptide to Control Autoimmune Encephalomyelitis and Prevent Disease Relapse

저널명 

Advanced Science

키워드 

Regulatory T cell (조절 T세포), Multiple sclerosis (다발성경화증), CTLA-4, Experimental autoimmune encephalomyelitis (자기면역성뇌척수염)

저  자

최제민 교수 (교신저자/ 한양대학교), 김길란 (제1저자/ 한양대학교), 김원주 (공동 제1저자/ 한양대학교), 임상호 (공동 제1저자/ Hubrecht Institute), 이홍균 (한양대학교), 구자현 (한양대학교), 남경호 (한양대학교), 김성민 교수 (서울대학교), 박성동 (한양대학교)

 

 

1. 연구의 필요성

 ○ 자가면역질환은 면역세포의 과도한 활성으로 자기 세포를 공격하여 나타나는 질환으로, 면역세포의 활성을 조절하는 조절 T 세포의 수가 감소되어 있어 이러한 조절 T 세포를 증가시켜 주는 것이 중요한 치료전략으로 여겨져 왔다. 

 ○ 환자의 몸에서 조절 T 세포를 분리하여 체외증식시킨 후, 다시 환자의 몸으로 주입하는 세포 치료제는 증식할 수 있는 세포 수가 한정적 이고, 환자의 몸에 다시 주입한 세포가 제대로 기능하지 못할 수 있어 새로운 치료제 개발의 필요성이 있었다.

 ○ 최근 연구들을 통해 조절 T 세포를 체내에서 증가시키는 전략이 소개 되었고, 여러 자가면역질환의 동물모델에서 질병 억제 효과가 있음이 확인되었다. 하지만 현재 조절 T 세포를 체내에서 증가시키는 치료제는 승인받은 바가 없다. 따라서 조절 T 세포를 체내에서 증가시키는 새로운 치료제의 개발이 요구되고 있었다.

 

2. 연구내용 

 ○ CTLA-4 단백질은 세포 외 도메인(extracellular domain)이 리간드(ligand) 와 결합해 세포에 신호전달을 일으키는 것으로 잘 알려져 있는데, 세포 내 도메인(cytoplasmic domain)만으로도 신호전달을 할 수 있음이 알려졌다. 

 ○ 본 연구에서 사용한 펩타이드는 CTLA-4의 세포 내 도메인을 세포 투과 단백질과 연결한 것으로, 이는 T 세포 내로 투과하여 신호 전달을 통해 조절 T 세포를 증가시킬 수 있다.※ligand : 수용체에 결합하는 물질

 ○ CTLA-4 펩타이드를 통해 증가된 조절 T 세포는 사이토카인 (cytokine)을 통해 분화시킨 조절 T 세포와 유사하게 T 세포 활성억제 효과를 가짐을 확인하였다.※cytokine : 면역세포가 분비하는 단백질. 미분화 T 세포를 여러 종류의 T 세포로    분화시킬 수 있다.

 ○ 다발성 경화증 동물모델에 조절 T세포를 결핍시키는 항체(anti- CD25)를 처리한 후, CTLA-4 펩타이드를 처리하면 다발성 경화증 억제효과가 완전히 사라지는 것을 통해 CTLA-4 펩타이드가 조절 T 세포를 통한 기작을 가짐을 확인하였다.

 ○ 기존 연구를 통해 CTLA-4 단백질의 세포내 도메인 중 타이로신 (tyrosine) 아미노산 도메인이 T 세포 활성 조절에 중요하다는 것이 밝혀져 있었다. 

 ○ 하지만 본 연구를 통해 CTLA-4 펩타이드의 라이신(lysine) 아미노산 도메인을 다른 아미노산으로 치환해 주었을 때, 조절 T 세포 증가 및 다발성 경화증 동물모델 질병 억제 효과가 사라졌다. 따라서 CTLA-4 펩타이드의 조절 T 세포를 증가시키는 기작에서는 라이신 아미노산 도메인이 중요하게 작용함을 새롭게 밝혔다.

 ○ 조절 T 세포는 전사인자(transcription factor)인 Foxp3 단백질의 발현을 통해 세포의 특징과 기능을 갖게 된다. 이러한 Foxp3의 발현에는 사이토카인의 한 종류인 TGF-β가 주요하게 작용한다. CTLA-4 펩타이드가 조절 T 세포를 증가시키는 기작으로, CTLA-4 펩타이드의 라이신 아미노산 도메인이 세포 내의 PKC-η 단백질과의 결합을 통해 TGF-β 하위 신호전달을 증가시켜 Foxp3의 발현을 증가시키는 기작을 규명하였다.

 ○ 기존 CTLA-4의 세포외 도메인을 이용한 CTLA-4-Ig(Abatacept)는 T 세포의 활성을 억제하며 류마티스 관절염의 치료제로 사용되고 있다. 세포 내 도메인을 이용한 CTLA-4 펩타이드는 조절 T 세포를 증가시키는 반면, CTLA-4-Ig는 오히려 조절 T 세포를 감소시키는 것을 확인하였다. 따라서 이 펩타이드는 자가면역질환에서 기존 치료제 보다 더 효과적으로 작용할 가능성을 확인할 수 있었다.

 ○ 다발성 경화증처럼 질병이 재발되는 동물모델에 CTLA-4 펩타이드를 투여하다가 중단하였을 때, 약 100일까지 질병 조절 효과가 있었으며 증가된 조절 T 세포에 의해 재발을 억제하여 장기간 효과가 있음을 알 수 있었다.

 ○ 정상인과 다발성 경화증 환자의 혈액세포에서 CTLA-4 펩타이드를 통해 조절 T 세포를 증가시킬 수 있음을 확인하였으며, 사람의 체내 환경을 모방한 동물모델에서도 CTLA-4 펩타이드를 통해 조절 T 세포가 증가됨을 확인하였다. 

○  다발성 경화증뿐만 아니라 다른 자가면역질환 모델인 건선 동물 모델 에서도 CTLA-4 펩타이드를 통한 조절 T 세포 증가 및 건선 완화 효과를 확인하였다. 

 

3. 기대효과

 ○ 본 연구는 CTLA-4 단백질 기반 펩타이드를 이용하여 조절 T 세포를 체내에서 증가시킴을 확인하였고, 그 기작을 규명하였다.

 ○ 관련 후속연구 및 심화 기작 연구를 통해 새로운 학문적 지식을 얻을 수 있을 것으로 기대된다.

 ○ 다발성 경화증뿐만 아니라 류마티스 관절염, 제1형 당뇨, 알츠하이머, 건선, 크론병 등 다양한 자가면역질환에 실마리가 될 수 있을 것으로 기대된다. 

 ○ 전임상 연구를 통해 향후 임상 연구 및 IND filing, 기술이전을 할 수 있을 것으로 기대되며, 현재 관련 기술을 기반으로 신약개발 성공을 위한 실험실 창업을 준비중이다.

 

 

그림 설명

 

 

 

 

 

(그림1) CTLA-4 펩타이드를 통해 조절 T 세포를 증가시켜 다발성경화증을 억제함

1) CTLA-4 단백질의 세포내 도메인(cytoplasmic domain, Y자 모양 빨간색으로 표시)을 혈관 뇌장벽(Blood-brain barrier)를 투과할 수 있는 세포 투과 펩타이드 서열인 dNP2 (초록색)와 연결하여 dNP2-ctCTLA-4 펩타이드를 개발하였다. 이 펩타이드는 T 세포 내로 전달되며, 조절 T 세포를 증가시킨다. 

2) 이 펩타이드의 라이신(lysine) 아미노산 도메인이 조절 T 세포 증가 기능에 중요하게 작용하며, 빅데이터 분석 연구인 염기서열 분석 및 단백질 분석을 통해 TGF-β 하위 신호를 증가시키는 기작을 확인하였다. 

3)  이 펩타이드의 라이신 도메인과 PKC-η 단백질간의 결합으로 TGF-β 하위 신호를 증가시키며 조절 T 세포에 중요한 전사인자(transcription factor)인 Foxp3를 증가시켜 조절 T 세포를 유도한다. 

4) 이 펩타이드는 다발성 경화증 동물모델과 정상인 및 환자 혈액세포에서 조절 T 세포를 증가시키며, 병증의 장기간 조절 및 재발 억제 효과를 가진다.

그림설명 및 그림제공 : 한양대학교 김길란 연구원

 

 

 

 

(그림 2) Advanced Science 커버이미지 (2021년 7월 21일 게재, 제14호) 

CTLA-4 펩타이드(그림에서 노란색으로 표시)는 혈관뇌장벽을 투과하여 뇌와 척수 내에 있는 T 세포(그림에서 왼쪽 상단에 있는 세포)에 전달될 수 있다. CTLA-4 펩타이드가 T 세포에 전달되면, 조절 T 세포(그림에서 날개달린 천사로 표현)로 분화하여 Th17 세포 (그림에서 날개달린 악마로 표현)의 염증반응을 조절, 다발성 경화증의 병증을 조절한다는 전략을 이미지로 표현하였다. 

* Th17 세포: 다발성 경화증에서 염증반응을 일으키는 세포.

그림설명 및 그림제공 : 한양대학교 김길란 연구원

 

 

 

 

 

(그림 3) CTLA-4 펩타이드의 다발성경화증 재발 억제 효과

다발성 경화증은 증상이 완화되었다가 다시 악화되며 재발한다. 다발성 경화증 동물모델에서 CTLA-4 펩타이드 처리 후 중단하더라도 약 100일까지 재발 조절 효과가 나타나는 것을 확인하였다. 

그림설명 및 그림제공 : 한양대학교 김길란 연구원 

 

 

 

 

(그림 4) CTLA-4 펩타이드에 의한 환자의 조절 T 세포의 분화 증가

다발성 경화증 환자의 혈액세포에 CTLA-4 펩타이드를 처리(오른쪽 dNP2-ctCTLA-4라고 표시)하자 펩타이드를 처리하지 않은 대조군(왼쪽 CTRL이라고 표시)에 비해 조절 T 세포의 중요한 전사인자인 Foxp3가 증가되었다. 유세포 분석기를 통해 Foxp3를 발현하는 세포가 증가하였음을 확인(왼쪽)하였고, 그에 대한 반복실험 결과(오른쪽)를 나타내었다.

 

그림설명 및 그림제공 : 한양대학교 김길란 연구원 

 

 

 

연구 이야기

 

                                           <작성 : 한양대학교 최제민 교수>

□ 연구를 시작한 계기나 배경은? 

 

조절 T세포(regulatory T cell)는 우리 몸의 면역의 항상성을 유지하는데 매우 중요한 세포이며, 자기관용(self-tolerance)을 갖는데 필수적인 세포임. 이러한 조절 T세포를 활용하거나 조절 T 세포를 유도하는 것은 자가면역질환 치료에서 가장 이상적인 접근으로 T세포와 자가면역을 연구하는 연구자로서는 가장 꿈에 가까운 연구 방향임.

 

CTLA-4 라는 T세포 면역관문 단백질에 대한 연구를 박사과정 대학원생 때부터 진행하여, 한 우물을 파고자 하는 철학을 바탕으로 끝까지 가보고자 하는 마음으로 CTLA-4 단백질 기반의 신약개발 연구를 수행하게 되었음.

 

선행연구들을 바탕으로 축적된 인프라, 노하우 등을 바탕으로, 본 연구에서는 CTLA-4 의 일부 도메인을 펩타이드로 제작하여, 보다 안정적인 약물 형태를 확보하고, 이를 기반으로 신약개발 연구 과제를 수주하여 다양한 연구진 및 협업기관들과 인연을 맺게 되어 더 힘을 얻게 되었음.

 

 

□ 연구 전개 과정에 대한 소개

 

선행연구 결과로서, 중추신경계 자가면역질환 치료적 접근을 위해 약물의 중추신경계 전달을 위한 펩타이드인 dNP2를 동정하고, CTLA-4 의 일부 도메인 전달을 통해 다발성경화증 동물모델에서의 치료연구를 확인한 (네이처 커뮤니케이션즈 2015 발표) 임상호 박사가 CTLA-4 신호전달 조절을 통해 조절 T세포를 유도해낼 수 있다는 결과를 얻고, 후속 연구를 김길란 학생이 이어서 진행하게 되었음.

 

김길란 학생이 CTLA-4 펩타이드를 통해 in vitro 와 in vivo에서 다양한 실험을 통해 T세포 면역 조절 및 조절 T세포 유도 효능을 확인하였고, 이러한 연구를 기초 연구적 접근을 위한 유전자 염기서열 분석 (RNA-sequencing), 분자기전 분석 기법적용 등을 위해 김원주 박사와 협업을 수행하였음. 다양한 조건의 RNA-sequencing 분석은 생물정보학적 분석기술을 요구하여 마크로젠, 인실리코젠 이라는 회사와의 긴밀한 협력이 필요했으며, 아주 광범위한 데이터의 분석 및 표현을 고민하였음.

 

실제 인간 T세포에서도 이러한 현상이 관찰될 수 있는지 확인하기 위해 면역세포가 결핍된 NSG 생쥐와 인간 혈액세포 (PBMC) 및 높은 순도로 분리된 CD4 T 세포를 활용한 연구를 김길란 학생이 수행하며 아주 큰 예산이 필요로 하는 연구를 수행하게 되었으며, 서울대학교 의과대학 신경과 김성민 교수와의 협업으로 다발성경화증 환자의 혈액세포를 제공받아 in vitro에서 환자의 T세포를 조절 T세포로 변화시켜 줄 수 있는지를 확인할 수 있었음. 

 

□ 연구하면서 어려웠던 점이나 장애요소는 무엇인지? 어떻게 극복(해결)하였는지?

 

본 연구실은 자연과학대학 생명과학과로서 일반적인 동물실험이나 기전연구에는 어려움이 없었으나, 환자샘플 혹은 인간 혈액세포에서의 기능을 in vivo에서 구현하기 위한 NSG 마우스 연구를 수행하는 것에 대해 기술적 어려움이 있었음.

 

다른 과제로 공동연구를 수행 중이었던 김성민 교수 (서울대학교 의과대학 신경과)로부터 환자 샘플을 제공받을 수 있었고, 김길란 학생이 큰 시행착오가 없이 처음 수행하는 실험들을 성공적으로 진행하면서 어려움을 해결해 나갈 수 있었음.

 

연구의 기술적 부분에 대한 위험도를 최소화하기 위해, 펩타이드 합성, 다발성경화증 동물모델 (EAE) 유도 kit, 혈액세포 구입과 같은 안정적인 연구재료를 활용하는 방식으로 위험을 최소화하였음.  

 

 

□ 이번 성과, 무엇이 다른가?

 

T세포, B세포와 같은 적응면역세포는 자기를 공격하지 않도록 발달과정에서 선택을 통해 자기관용을 얻게 됨 . 하지만 여전히 자기를 공격할 수 있는 면역세포가 존재할 수 있으며, 또한 과도한 면역반응을 조절할 수 있는 시스템으로서 조절 T세포는 매우 중요한 세포임. 따라서 전 세계적으로 조절 T세포를 이용한 자가면역질환 치료에 기대를 하고 있음.

 

이러한 배경에서, CTLA-4 라고 하는 조절 T세포의 기능에 아주 중요한 역할을 하는 단백질의 신호전달 도메인을 이용하여 미분화 T 세포 (naive T cell) 로부터 조절 T 세포 (regulatory T cell)을 유도할 수 있는 펩타이드 신약 후보물질을 도출했다는 점에서 큰 의의가 있음. 

 

본 연구를 통하여 다발성 경화증 동물 모델에서 병증을 악화시키는 Th1, Th17 세포는 억제하고, 조절 T 세포는 증가시키는 기전을 통하여 질병을 치료하고, 나아가 재발을 막을 수 있었다는 점에서 큰 의미가 있음.

 

 

 

□ 실용화된다면 어떻게 활용될 수 있나? 실용화를 위한 과제는? 

 

도출된 조절 T세포 유도 펩타이드는 최소 서열로의 최적화, 독성, 면역원성이 낮은 서열로의 최적화, 안정성이 우수한 서열로의 최적화 등으로 유도체 개발 등의 후속연구를 수행할 계획임.  이는 국가신약개발사업단 연구 및 실험실 창업을 통한 연구로 비임상 연구 완료 및 임상연구 진입 수준의 후속 연구를 진행할 계획임. 

 

치료효과와 더불어 약물로서 필요한 생체내 안전성, 안정성, 대량생산의 용이성 등 다양한 측면에서의 연구가 이루어져야 하며 펩타이드 약물로서의 약점을 극복할 수 있는 최적화 연구가 중요한 과제로 여겨짐.

 

□ 꼭 이루고 싶은 목표나 후속 연구계획은? 

 

논문으로 남는 성과가 아닌, 실제 임상 현장에서 쓰일 수 있기를 희망하며 후속연구를 계획하고 있음. 서열 최적화 등을 통한 유도체 개발연구 등을 포함, 비임상 연구완료와 임상연구 진입 수준의 후속연구를 진행할 계획임.

 

 

□ 기타 특별한 에피소드가 있었다면?

 

1. 많은 경우에 겪는 일이듯이 본 연구가 한참 진행되던 시기에 Jeffrey Bluestone 그룹에서 Nature Medicine 2018에 항체 기반의 조절 T세포 연구결과를 발표하였고, Shimon Sakaguchi 그룹에서는 화합물 반응으로 Science Immunology 2019 에 조절 T세포 유도 약물 연구결과를 발표하였으며, Aiden Haghikia 그룹에서 Cell 2020 에 지방산 보조제를 이용한 다발성경화증 환자에서의 조절 T세포 증가와 질병 호전의 관계를 발표하여, 초초한 마음을 가지며 연구하였음. 비슷한 방향의 연구들이 연구의 진행과정에서 발표된다는 점은 긍정적인 신호인 동시에, 또한 새로운 연구결과를 먼저 발표하고자 하는 연구자들 간의 경쟁을 느낄 수 있었음.

 

2. 논문 심사 과정에서 통계분석에 대한 아주 상세한 수정 요청이 있었으며, 이를 계기로 학교 통계 자문실을 통한 수차례 자문 및 통계분석 방법 공부를 통해, 생명과학 연구 데이터를 적절한 통계방법으로 분석할 수 있게 되었음. 통계적 유의성 및 적절한 샘플수를 구하는 방법에 대한 질문을 답변하기 위해 대부분의 데이터의 n수를 더 확보해야 하는 수준의 재시험 분석을 수행했어야 했음.